Zadanie 15.
Wirusowe zapalenie wątroby typu C (WZW typu C) jest chorobą wywołaną przez wirus
zapalenia wątroby typu C (HCV), którego genom stanowi pojedyncza nić RNA. Większość
infekcji wywołanych HCV ma przebieg bezobjawowy. W niektórych przypadkach dochodzi
do samoistnej eliminacji HCV przez układ odpornościowy (spontaniczne wyzdrowienie).
Większość zakażeń przechodzi jednak w infekcje przewlekłe, co może prowadzić
do zapalenia wątroby, do jej marskości i do rozwoju nowotworu wątroby. Przewlekłym
infekcjom HCV towarzyszy ciągłe uwalnianie do krwi cząstek wirusa z zakażonych
hepatocytów. Nie opracowano dotąd skutecznej szczepionki przeciw HCV.
Na podstawie: J. Bal, Genetyka medyczna i molekularna, Warszawa 2018;
W. Irving i in., Krótkie wykłady. Mikrobiologia medyczna, Warszawa 2008.
Odpowiedź: 15.1. Obecność przeciwciał anty-HCV świadczy o tym, że organizm kiedyś zetknął się z wirusem i wytworzył przeciw niemu odpowiedź immunologiczną — ale nie o tym, że wirus jest obecny obecnie. U części zakażonych dochodzi do samoistnej eliminacji HCV (spontanicznego wyzdrowienia). Po zakończonej, skutecznej odpowiedzi immunologicznej wirusa już nie ma, natomiast wytworzone wcześniej przeciwciała utrzymują się we krwi bardzo długo — są produkowane przez długowieczne komórki plazmatyczne i limfocyty B pamięci. Dodatni wynik testu na przeciwciała oznacza więc jedynie przebyty kontakt z wirusem. Aby stwierdzić aktywne zakażenie, trzeba wykryć sam materiał genetyczny wirusa (RNA HCV) metodą molekularną. 15.2. PCR jest reakcją powielającą DNA — polimeraza DNA używana w tej metodzie potrzebuje matrycy DNA, a nie RNA. Genom HCV stanowi natomiast pojedyncza nić RNA. Aby móc go powielić, trzeba najpierw przepisać informację z RNA na DNA. Katalizuje to odwrotna transkryptaza — enzym syntetyzujący DNA na matrycy RNA (powstaje tzw. cDNA, komplementarne DNA). Dopiero uzyskane cDNA może posłużyć jako substrat w reakcji PCR. Cała procedura nosi nazwę RT-PCR (reverse transcription PCR).
\nTreść zadania (CKE)
\nDwa rodzaje testów w diagnostyce zakażeń
\nCecha | Test serologiczny (przeciwciała) | Test molekularny (RT-PCR)
co wykrywa | przeciwciała wytworzone przez organizm | materiał genetyczny wirusa
co oznacza wynik dodatni | kontakt z patogenem (kiedykolwiek) | aktywne zakażenie
kiedy wykrywalny | po kilku tygodniach od zakażenia | od kilku dni
czy odróżnia zakażenie czynne od przebytego | nie | tak
zastosowanie | badania przesiewowe, ocena odporności | potwierdzenie, monitorowanie leczenia
Schemat diagnostyki WZW typu C: najpierw test na przeciwciała anty-HCV (tani, przesiewowy), a przy wyniku dodatnim — RT-PCR potwierdzający obecność wirusa.
\nRT-PCR krok po kroku
\n$$\\underset{\\text{genom HCV}}{\\text{RNA}} \\xrightarrow[\\text{odwrotna transkryptaza}]{\\ \\textbf{odwrotna transkrypcja}\\ } \\underset{\\text{komplementarne DNA}}{\\text{cDNA}} \\xrightarrow[\\text{polimeraza DNA}]{\\ \\textbf{PCR}\\ } \\text{miliony kopii DNA}$$
\nEtap | Enzym | Matryca | Produkt
odwrotna transkrypcja | odwrotna transkryptaza | RNA | cDNA
PCR | polimeraza DNA (Taq) | DNA | powielone DNA
Etapy jednego cyklu PCR
\nEtap | Temperatura | Co się dzieje
denaturacja | ~95 °C | rozdzielenie nici DNA
przyłączanie starterów (annealing) | 50–65 °C | startery wiążą się z matrycą
wydłużanie (elongacja) | ~72 °C | polimeraza syntezuje nową nić
Po $n$ cyklach liczba kopii rośnie wykładniczo:
\n$$N = N_0 \\cdot 2^n$$
\nPo 30 cyklach jedna cząsteczka daje ponad miliard kopii. Kluczowym składnikiem jest termostabilna polimeraza Taq, pochodząca z bakterii Thermus aquaticus żyjącej w gorących źródłach.
\nOdwrotna transkryptaza
\nCecha | Opis
reakcja | synteza DNA na matrycy RNA
kierunek przepływu informacji | RNA → DNA — odwrotnie do „dogmatu" biologii molekularnej
naturalne pochodzenie | retrowirusy (HIV, HTLV), retrotranspozony
zastosowania | RT-PCR, tworzenie bibliotek cDNA, sekwencjonowanie RNA
leki hamujące ten enzym | AZT, tenofowir (terapia HIV)
Uwaga: HCV nie jest retrowirusem. Namnaża się przez polimerazę RNA zależną od RNA i nigdy nie przechodzi przez etap DNA — dlatego odwrotna transkryptaza w jego diagnostyce jest wyłącznie narzędziem laboratoryjnym.
\nDlaczego nie ma szczepionki przeciw HCV
\nPrzyczyna | Opis
duża zmienność genetyczna | polimeraza RNA nie ma zdolności korekty — wysoka częstość mutacji
liczne genotypy i podtypy | co najmniej 7 głównych genotypów
quasi-gatunki | u jednego pacjenta krąży pula wariantów wirusa
ucieczka immunologiczna | zmienne białka powierzchniowe
Dobra wiadomość: od 2014 r. dostępne są leki bezpośrednio działające przeciwwirusowo (DAA), które wyleczają ponad 95% zakażeń w 8–12 tygodni.
\nPrzebieg zakażenia HCV
\nScenariusz | Częstość | Skutek
samoistna eliminacja | ok. 15–25% | wyzdrowienie, przeciwciała pozostają
zakażenie przewlekłe | ok. 75–85% | zapalenie → włóknienie → marskość → rak wątrobowokomórkowy
To właśnie istnienie pierwszego scenariusza sprawia, że sam dodatni wynik testu na przeciwciała jest niejednoznaczny.
\nPunktacja CKE
\nTypowy błąd: W 15.1 klucz wymaga odniesienia do zakończonej odpowiedzi immunologicznej. Nie wystarczy napisać, że „przeciwciała długo się utrzymują" — trzeba powiązać to z wyeliminowaniem wirusa przez układ odpornościowy. W 15.2 klucz odrzuca odpowiedzi tautologiczne. Sformułowanie „odwrotna transkryptaza katalizuje reakcję odwrotnej transkrypcji" nie punktuje — trzeba wyjaśnić, co ten enzym robi: syntezuje DNA na matrycy RNA. Klucz odrzuca też nazwanie HCV retrowirusem. HCV nie jest retrowirusem — nie ma własnej odwrotnej transkryptazy i nie integruje się z genomem gospodarza. Odwrotna transkryptaza używana w diagnostyce jest odczynnikiem laboratoryjnym, a nie enzymem wirusa. Odpowiedź w 15.2 musi zawierać trzy elementy: (1) materiał genetyczny HCV to RNA, (2) PCR powiela DNA, (3) odwrotna transkryptaza przepisuje RNA na DNA. Nie myl testu serologicznego z molekularnym. Test na przeciwciała wykrywa odpowiedź organizmu; test PCR wykrywa samego wirusa. To dwa różne pytania diagnostyczne. Uwaga na okno serologiczne. Zaraz po zakażeniu przeciwciał jeszcze nie ma — wynik ujemny nie wyklucza wtedy infekcji. RT-PCR wykrywa wirusa znacznie wcześniej.
"}]}